1. Le cellule da crioconservare devono essere in uno stato di buona crescita (fase log) e alto tasso di sopravvivenza, con una densità di circa 80-90%.
2. Verificare se le cellule conservano ancora le loro proprietà uniche prima del congelamento.
Ad esempio, l'ibridoma dovrebbe essere testato per la produzione di anticorpi uno o due giorni prima della crioconservazione.
3. Prestare attenzione alla qualità del crioprotettore.
Il DMSO deve essere di grado reagente, sterile e incolore (filtrato con 0,22 micron FGLP Telflon o prodotti sterili acquistati direttamente, come Sigma D-2650), aliquotato in piccoli volumi di 5-10 ml, conservato a 4 oC al buio. Non scongelare più volte. Anche il glicerolo deve essere di grado reagente e conservato al buio dopo la sterilizzazione in autoclave. Utilizzare entro un anno dall'apertura, perché sarà tossico per le cellule dopo una conservazione a lungo termine.
4. Concentrazione cellulare per la crioconservazione:
(1) Fibroblasto umano normale: 1~3 x 106 cellule/ml
(2) Ibridoma: 1~3 x 106 cellule/ml, la concentrazione cellulare non dovrebbe essere troppo alta, alcuni ibridomi moriranno dopo 24 ore di scongelamento a causa dell'elevata concentrazione di congelamento.
(3) Linee tumorali aderenti: 5~7 x 106, a seconda del tipo di cellula. L'adenocarcinoma richiede una concentrazione maggiore dopo lo scongelamento, mentre HeLa necessita solo di 1-3 x 106 cellule/ml.
(4) altre sospensioni: 5~10 x 106 cellule/ml, i linfociti umani devono essere almeno 5 x 106 cellule/ml.
5. La concentrazione del crioprotettore è del 5 o del 10% di DMSO. Se le condizioni di congelamento delle cellule sono incerte, è necessario utilizzare una coltura di backup durante la crioconservazione per evitare il fallimento del congelamento.
6. Metodo di congelamento:
(1) Metodo tradizionale: 4 oC 10 minuti ---> -20 oC 30 minuti ---> -80 oC 16-18 ore (o durante la notte) ---> Stoccaggio a lungo termine nella fase vapore del serbatoio di azoto liquido .
(2) Raffreddamento programma: utilizzare una macchina di raffreddamento a velocità costante per ridurre dalla temperatura ambiente a –120 oC a una velocità di –1 ~ -3 oC/min e conservarla nella fase vapore di un serbatoio di azoto liquido per lungo tempo. conservazione a termine. È adatto per la conservazione delle cellule di sospensione e dell'ibridoma.
7. Materiale:
(1) Cellule coltivate che crescono bene
(2) Mezzo fresco
(3) DMSO (Sigma D-2650)
(4) Provetta sterile per crioconservazione in plastica (Nalgene 5000-0020)
(5) 0,4% p/v blu trypan (GibcoBRL 15250-061)
(6) Piastra dell'emocitometro e vetro di copertura
(7) Macchina di raffreddamento a velocità costante (KRYO 10 Serie II)
8. Passaggi:
(1) Cambiare la metà o l'intera quantità di mezzo un giorno prima del congelamento e osservare la crescita cellulare.
(2) Preparazione della soluzione di crioconservazione (preparazione prima dell'uso): aggiungere DMSO al terreno fresco, la concentrazione finale è del 5-10%, mescolare bene e metterlo a temperatura ambiente per un uso successivo.
(3) Secondo l'operazione di subcoltura cellulare, raccogliere le cellule coltivate e prendere una piccola quantità di sospensione cellulare (circa 0,1 ml) per contare la concentrazione cellulare e il tasso di sopravvivenza prima del congelamento.
(4) Centrifugare, rimuovere il supernatante, aggiungere una quantità adeguata di soluzione di crioconservazione per rendere la concentrazione cellulare 1-5 x 106 cellule/ml, mescolare bene e dispensare nella provetta di crioconservazione etichettata, 1 ml/flaconcino, e prendere una piccola quantità di sospensione cellulare per il rilevamento della contaminazione.
(5) Metodo di crioconservazione 1: il criotubo viene posto a 4 oC per 10 minuti → -20 oC per 30 minuti → -80 oC per 16-18 ore (o durante la notte) → fase vapore del serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
(6) Metodo di conservazione per congelamento 2: il tubo di congelamento viene posizionato in una macchina di raffreddamento a velocità costante con un programma prestabilito, quindi collocato in un serbatoio di azoto liquido.
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