Summary: Dopo che un laboratorio ha ottenuto una nuova linea cellulare, la linea cellulare deve essere prima coltivata ed espansa e quindi congelata. La crioconservazione delle cellule può essere utilizzata in primo luogo come riserva quando le c......
Dopo che un laboratorio ha ottenuto una nuova linea cellulare, la linea cellulare deve essere prima coltivata ed espansa e quindi congelata. La crioconservazione delle cellule può essere utilizzata in primo luogo come riserva quando le cellule vengono perse a causa dell'inquinamento e di altre condizioni. Inoltre, quasi tutte le cellule subiscono un certo grado di variazione durante il processo di coltura e passaggio. Al fine di mantenere la coerenza dei risultati sperimentali, generalmente le cellule non possono essere coltivate per dozzine di generazioni. Se viene utilizzato di nuovo, è necessario scongelare e coltivare le cellule crioconservate e meno transitate prima dell'uso.
Ci sono quattro punti principali nel processo di congelamento cellulare: raccolta cellulare, uso di agenti protettivi, velocità di congelamento e ambiente di conservazione.
Raccolta cellulare
Le cellule utilizzate per la crioconservazione sono generalmente selezionate quando le cellule sono circa il 90% confluenti. In questo momento, la crescita cellulare è buona e il numero di cellule è elevato e il mezzo di coltura deve essere cambiato 24 ore prima della raccolta delle cellule. Il metodo di raccolta delle cellule per la crioconservazione è lo stesso del solito. Centrifugare a 100xg per 5 minuti per raccogliere le cellule e risospenderle. Le cellule vive vengono contate. Diluire o concentrare fino al doppio della concentrazione cellulare finale per la conservazione delle cellule (di solito 4-10 milioni di cellule/ml), aggiungere un volume uguale della soluzione della miscela di agente protettivo del mezzo di coltura che è stata preparata e mescolare delicatamente e aliquotare nella provetta di crioconservazione, crioconservazione.
Uso di agenti protettivi.
Nella crioconservazione cellulare, il DMSO è generalmente utilizzato come agente protettivo. Nella crioconservazione cellulare, la concentrazione finale di DMSO utilizzata è generalmente del 5-15%. La concentrazione di DMSO nella soluzione di crioconservazione di una cellula specifica può essere trovata da ATCC. Per le cellule particolarmente sensibili, in particolare le cellule di ibridoma, potrebbe essere meglio utilizzare il 95% di siero e il 5% di DMSO durante la crioconservazione. Quando si utilizza l'agente protettivo, utilizzare il mezzo di coltura o il siero per ottenere il doppio della concentrazione finale, quindi mescolarlo con un volume uguale di mezzo di coltura cellulare in sospensione. Velocità di congelamento cellulare
La velocità di congelamento delle cellule è meglio controllata per consentire un tempo sufficiente per disidratare le cellule senza essere danneggiate da un'eccessiva disidratazione. Per la maggior parte delle celle, è appropriato un calo di temperatura da 1 a 3°C al minuto. L'operazione usuale consiste nel mettere le celle a -20°C per 1-2 ore, quindi metterle nel frigorifero a -80°C per una notte (se non c'è il frigorifero a -80°C, si può usare invece del ghiaccio secco), e quindi trasferire nel serbatoio di azoto liquido o inferiore a -130 Conservazione a lungo termine in frigorifero a ℃.
Ambiente di archiviazione
La temperatura di conservazione a lungo termine delle celle è -130 ℃ o inferiore. La temperatura dello strato gassoso nel serbatoio di azoto liquido è compresa tra -140 ℃ e -180 ℃. Le cellule possono essere immagazzinate nello strato gassoso o immerse in azoto liquido. Se possibile, è meglio conservare nello strato gassoso, perché può evitare che l'azoto liquido entri nel deposito di congelamento. Il tubo provoca un'esplosione quando le celle vengono estratte (ma in questo modo solo una piccola quantità di azoto liquido può essere immagazzinata nel serbatoio di azoto liquido, che deve essere aggiunto frequentemente). Le cellule possono anche essere conservate in frigorifero a -80 ℃ per alcuni mesi circa.
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